《植物业生物技术》课程实验教学大纲

　　 　　

　　课程编号：0130000042
　　一、 实验要求
　　要求学生通过本课程实验教学，加深理解和巩固所学理论知识，掌握一些生物技术基本实验技能，学会设计试验，正确使用常规仪器，正确记录，合理分析、讨论实验结果。同时加强对学生进行科学素质和良好的实验室工作习惯的训练。
　　二、实验教学条件
　　bat365在线平台官方网站分子生物学实验室已具备分子生物学试验的基本条件，可满足“细菌质粒提取”实验的顺利完成；bat365在线平台官方网站细胞工程实验室具备细胞培养的基本条件，可满足“植物转基因”综合设计实验的完成。
　　三、实验材料
　　植物：油菜、烟草等。
　　微生物：大肠杆菌和农杆菌。
　　四、实验课主要内容
 　　

序号	实验项目	学时	实验类别（基础实验、综合实验、设计实验等）	实验类型（上机、实验等）	实验内容	具体要求
1	细菌质粒提取	2	基础实验
2	农杆菌介导的植物遗传转化	8	综合设计实验		农杆菌培养； 植物外植体培养； 农杆菌转化植物； 转化体筛选	实验设计完整可行；能熟练掌握无菌操作技术。
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　　五、考核方式与评分办法
　　1． 实验设计方案  30％；
　　2． 试验操作和技能 40％；
　　3． 试验结果与分析  30％。
　　实验一  质粒DNA的提取
　　（基础实验）
　　实验目的
　　使学生了解细菌质粒提取的不同方法，掌握细菌培养的方法和大肠杆菌质粒微量提取的方法。
　　实验原理
　　碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
　　仪器、材料与试剂
　　仪器：恒温培养箱、恒温摇床、小型高速离心机、高压灭菌锅。
　　材料：带有质粒的大肠杆菌
　　试剂：
    Solution I
        50mmo1／L  葡萄糖
        5mmo1／L  三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
        1.0 mmo1／L  乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
    Solution II
        0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
    Solution III
        5mo1／L 醋酸钾  60  mL
        冰乙酸          11.5mL
        水              28.5mL
    TE缓冲液
        10mmo1／L Tris·HCl
         1mmo1／L EDTA(pH8.0)
    胰RNA酶(RNA酶A)
　　将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
实验步骤 （采用SDS碱裂解法小量制备质粒DNA）
　　1．大肠杆菌培养
　　2．提取质粒
　　3．质粒的琼脂糖凝胶电泳
　　实验操作步骤
　　1．将过夜培养的2m1细菌，高速离心1分钟，彻底去除上清。
　　2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
　　3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
　　4．加入400ml Solution III，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
    注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
　　5．高速离心，15,000转／分钟，10分钟。无需低温离心。
    注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
　　6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
　　注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
　　离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
　　7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
　　注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
　　11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。

　　实验二 农杆菌介导的植物遗传转化
　　（综合设计实验）
　　（一）实验目的
　　1．使学生全面了解农杆菌介导的植物转基因的方法；
　　2．使学生根据已学的知识，在教师指导下设计一个农杆菌介导植物的遗传转化实验方案；
　　3．使学生掌握农杆菌培养，植物外植体无菌系建立，农杆菌侵染和转化体筛选等一系列试验方法。
　　（二）培养基
　　1．LB培养基：每升含有：酵母浸膏 5 g , 胰蛋白胨 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.2
　　2．YEB培养基：每升含有：牛肉浸膏 5 g ，酵母浸膏 1 g ,蛋白胨 5 g ，蔗糖 5 g ，MgSO4·H2O 0.5 g ，PH 7.0
　　　3．YEP培养基：每升含有：牛肉浸膏 10 g ，酵母提取液 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.0
　　4．实生苗培养基： 1/2MS培养基，附加30g蔗糖和0.6％琼脂，PH=6.0。
　　5．预培养基：MS+1.0～1.2mg/L  2，4-D+0.2mg/L 6-BA+30g蔗糖+6g琼脂，PH=5.8。
　　6．分化培养基：MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+30g蔗糖+6.5g琼脂+AgNO36mg/L， PH=5.8。
　　7．筛选培养基：分化培养基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L Kan，PH=5.8。
　　（三）试验仪器
　　超级超净工作台
　　智能气候培养箱
　　大型落地式高速冷冻离心机
　　凝胶成像系统
　　台式常温高速离心机
　　立式灭菌锅
     电泳相关设备
　　（四）农杆菌介导植物转化实验步骤（以油菜子叶转化为例）
　　1．根癌农杆菌的培养
　　将保存于甘油中的菌种用划线法接种于LB固体平板培养基上培养，每次转化前一天从平板上挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，在26℃，170r/min的摇床上过夜培养，当OD600值达0.3～0.5时，将其在4000r/min的条件下离心5min，弃去上清，然后用液体MS培养基将其重悬稀释5～8倍待用。
　　2．建立无菌苗
　　将油菜种子用75%酒精浸泡30s后，于0.1%HgCl2溶液中处理10min，无菌水冲洗3次后，接种于1/2MS固体培养基上，在25±1℃黑暗条件下培养3d，后移至光下培养1～3d，取其下胚轴和带柄子叶接种在预培养基上，在25℃，光照强度为2000lux，16h光照周期培养条件下培养，待用。
　　3．农杆菌侵染
　　在无菌条件下，将预培养2d子叶和下胚轴收集于一个无菌小烧杯中，浸入于活化并稀释了5～8倍的农杆菌液中，5min后转到无菌滤纸上，吸干多余的菌液，接至共培养培养基中，在25℃生化培养箱中共培养2 d。
　　4．分化培养 
　　将共培养2d的受体材料先用无菌水冲洗2～3次至水澄清后，用500mg/LCef浸泡30～40min，材料取出并置于含有无菌滤纸的培养皿中干燥2d。将培养物转移至附加8～15mg/L卡那霉素和500mg羧苄青霉素（或头孢霉素）的分化培养基中，在25℃，昼夜光周期为16／8h恒定光照条件下培养，
　　5．筛选培养
　　将分化培养中获得的绿芽移置筛选培养基（卡那霉素浓度升致25mg/L），每隔15～20d转接一次。
　　注：上述方法步骤供学生设计实验方案时参考。学生可自己设计烟草的遗传转化实验方案。